Xác định gen gây độc và tính đa dạng di truyền

v
cứu, ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại không những phục vụ trực tiếp cho công
tác chọn giống vi sinh, mà còn phục vụ cho công tác bảo vệ thực vật trên thực tế.














































vi
MỤC LỤC

CHƢƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Mục lục vi
Danh sách các chữ viết tắt ix
Danh sách các bảng x
Danh sách các hình xi

1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích và yêu cầu đề tài 2
1.2.1. Mục đích 2
1.2.2. Mục tiêu 3
1.2.3. Yêu cầu nghiên cứu 3
1.3. Đối tƣợng nghiên cứu 3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1. Vai trò của biện pháp phòng trừ sinh học trong bảo vệ thực vật hiện nay 4
2.2. Giới thiệu về nấm ký sinh trên côn trùng 4
2.2.1. Giới thiệu về nấm Metarrhizium anisopliae. 5
2.2.2. Hiệu quả phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm. 9
2.3. Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên côn trùng. 10
2.4. Hoạt tính sinh học 13
2.5. Một số nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc về nấm Metarrhizium anisopliae
và những nấm ký sinh côn trùng khác ứng dụng để phòng trừ sâu hại. 17
2.5.1. Nghiên cứu trong nƣớc 17
2.5.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc 17
2.6. Vai trò của protease Pr1 18
2.7. Phƣơng pháp phát hiện gen Pr1 19
2.8. Phản ứng PCR 20
2.8.1. Giới thiệu chung về PCR 20
2.8.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng PCR 21
2.8.3. Các ứng dụng của phƣơng pháp PCR 23
2.8.3.1. Sử dụng phƣơng pháp PCR tổng hợp mẫu dò cho các thử nghiệm
S
1
nuclease 23
2.8.3.2. Sử dụng PCR để sàng lọc 23
2.8.3.3. Sử dụng PCR cho việc thiết kế nhanh các gen tổng hợp 24
2.8.3.4. Sử dụng PCR trong việc kiểm nghiệm 24
2.8.3.5. Định lƣợng bằng phƣơng pháp PCR 25
2.8.3.6. Một số ứng dụng khác của kỹ thuật PCR 26
2.8.4. Những hạn chế của phƣơng pháp PCR 26
2.9. Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 27
2.9.1. Nguyên tắc hoá học: phƣơng pháp Maxam và Gilbert 28
2.9.2. Phƣơng pháp enzyme học thông qua việc sử dụng các dideoxynucleotid
của Sanger. 28


vii
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
3.1. Thời gian và địa điểm 30
3.1.1. Thời gian 30
3.1.2. Địa điểm 30
3.2. Vật liệu và hoá chất 30
3.2.1. Vật liệu 30
3.2.1.1. Mẫu thí nghiệm 30
3.2.1.2. Các primer dùng trong khuếch đại gen và giải trình tự 31
3.2.2. Hoá chất và môi trƣờng 31
3.2.2.1. Các hóa chất dùng để chiết tách DNA từ khối sợi nấm 31
3.2.2.2. Các hóa chất dùng trong điện di 31
3.2.2.3. Hóa chất cho phản ứng PCR (do công ty Bio - Rad cung cấp) 32
3.2.2.4. Môi trƣờng 32
3.2.3. Các thiết bị chính 32
3.3. Nội dung nghiên cứu 32
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 33
3.4.1. Phân lập và tách chủng nấm Metarrhizium anisopliae trên một số sâu
hại cây trồng 33
3.4.1.1. Chuẩn bị môi trƣờng PGA 33
3.4.1.2. Phƣơng pháp tách bào tử 33
3.4.2. Xác định qui trình PCR phát hiện gen Pr1 liên quan tới tính độc
của nấm Metarrhizium anisopliae 33
3.4.2.1. Chuẩn bị môi trƣờng lỏng nhân sinh khối sợi nấm 33
3.4.2.2. Phƣơng pháp ly trích DNA 34
3.4.2.3. Phƣơng pháp tinh sạch DNA 34
3.4.2.4. Khuếch đại gen Pr1-PCR 35
3.4.2.5. Điện di trên gel agarose 36
3.4.2.6. Đọc kết quả điện di 37
3.4.3. Sử dụng phƣơng pháp giải trình tự để xác định và phát hiện sự sai khác
cụ thể trong đa dạng di truyền nấm Metarrhizium anisopliae 37
3.4.3.1. Tinh sạch sản phẩm PCR 37
3.4.3.2. Lƣợng DNA thích hợp cho đọc trình tự 38
3.4.3.3. Thành phần của phản ứng đọc trình tự 39
3.4.3.4. Quy trình nhiệt của phản ứng PCR trong đọc trình tự 39
3.4.3.5. Tinh sạch sản phẩm PCR 39
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41
4.1. Phân lập, tách chủng nấm Metarrhizium anisopliae trên một số
sâu hại cây trồng 41
4.2. Sử dụng phƣơng pháp PCR phát hiện gen liên quan đến tính độc của
nấm Metarrhizium anisopliae, gen protease (Pr1). 43
4.2.1. Quy trình ly trích DNA của các mẫu nấm Metarrhizium anisopliae. 43
4.2.2. Tiến hành phản ứng PCR 45
4.2.3. Xác định trình tự nucleotide trong đoạn gen gây độc Pr1 của nấm
Metarrhizium anisopliae. 47
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53
5.1. Kết luận 53
5.1.1. Phân lập, tách chủng nấm Metarrhizium anisopliae 53


viii
5.1.2. Phƣơng pháp ly trích DNA và kỹ thuật PCR 53
5.1.3. Phƣơng pháp đọc trình tự gen Pr1 53
5.2. Đề nghị 53
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 56
7. PHỤ LỤC 59















































ix
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BXĐTG1 : Bọ xít đen Tiền Giang 1
BXĐTV7 : Bọ xít đen Trà Vinh 7
BXĐLA3 : Bọ xít đen Long An 3
BXĐLA8 : Bọ xít đen Long An 8
RBCQ915 : Rầy bông cúc Quận 9 15
RBCQ2 : Rầy bông cúc Quận 2
BDQ96 : Bọ dừa Quận 9 6
BDTV1 : Bọ dừa Trà Vinh 1
BDTN4 : Bọ dừa Tây Ninh 4
BDLA8 : Bọ dừa Long An 8
SCLLLA1 : Sâu cuốn lá lúa Long An 1
RNBT1.5 : Rầy nâu Bến Tre 1.5
ng : nano gram
nm : nano mol
g : micro gram
m : micro mol
M : micro mol/lít
l : micro lít
TE : tris EDTA
dNTP : deoxyribonucleotide – 5 – trphosphate
TAE : tris acetic EDTA
UI : unit international
bp : base pair
Kb : kilo base
CZA : Czapek – Dox
SDS : Sodium dodecyl sulphate
PGA : Potato glucose agar
IPM : Intergrated pest management
SDA : Soduim dedocyl sulphate
RFLP : Restriction Fragment Lengh Polymorphism
RAPD : Random Amlification of Polymorphic DNA
Tm : melting temperature
ctv : cộng tác viên
PCR : Polymerase Chains Reaction










x

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG

Bảng 2.1: Enzyme của một số loài nấm diệt sâu 14
Bảng 2.2: Hoạt tính phân hủy chitin và protein của một số nấm diệt sâu 15
Bảng 2.3: Sự liên quan giữa hoạt tính enzyme với độc tính diệt sâu 16
Bảng 4.1: Nguồn nấm Metarrhizium anisopliae đƣợc thu thập ở một số địa
phƣơng dùng trong thí nghiệm 41
Bảng 4.2: Các nguồn nấm Metarrhizium trên genbank đƣợc dùng để so sánh. 48
Bảng 4.3: So sánh trình tự nucleotid đoạn gen Pr1 của hai mẫu BXĐTG1,
BXĐTV7 với các trình tự trên genbank. 49



































xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG

Hình 2.1: Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên những côn trùng khác
nhau 9
Hình 2.2: Chế phẩm nấm Metarrhizium anisopliae trên thị trƣờng:
metanat – CE 10
Hình 2.3: Chu kỳ xâm nhập của nấm ký sinh trên côn trùng, Metarrhizium
anisopiae 11
Hình 2.4: Sự xâm nhập của nấm trên lớp vỏ thân sâu rốm ở mức vi mô 12
Hình 2.5: Mối bị nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh đƣợc chụp dƣới kính
lúp
sôi nổi ở độ phóng đại 40 lần 12
Hình 3.1: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR 36
Hình 4.1: Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên rầy nâu 42
Hình 4.2: Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên bọ dừa 42
Hình 4.3: Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên sâu cuốn lá lúa 42
Hình 4.4: Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên bọ xít đen 42
Hình 4.5: Sự nảy mầm của bào tử nấm Metarrhizium anisopliae dƣới kính
hiển vi ở độ phóng đại 400 lần 42
Hình 4.6: Khuẩn lạc nấm Metarrhizium anisopliae sau khi tách đơn bào tử 43
Hình 4.7: Kết quả ly trích DNA của các nguồn nấm Metarrhizium anisopliae 44
Hình 4.8: DNA của các nguồn nấm Metarrhizium anisopliae sau khi đƣợc xử lý
với RNAse 44
Hình 4.9: Kết quả phát hiện gen Pr1 của các nguồn nấm qua PCR 48
Hình 4.10: Hình cây phát sinh loài 53

CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Tình hình dân số ngày càng gia tăng, nhu cầu của con ngƣời sử dụng lƣơng
thực ngày càng cao cả về số lƣợng và chất lƣợng. Do đó, mục tiêu đặt ra là sản xuất
nông nghiệp phải đạt năng suất cao và ổ định. Để bảo vệ mùa màng khỏi bị các đối
tƣợng dịch hại tấn công, ngƣời ta đã đƣa ra nhiều phƣơng pháp khác nhau trong đó
phƣơng pháp sử dụng thuốc trừ sâu hóa học vẫn còn đang chiếm ƣu thế hiện nay. Tuy
nhiên, việc sử dụng nhiều thuốc hoá học sẽ gây ra những hậu quả không mong muốn
nhƣ ảnh hƣởng xấu đến sức khoẻ con ngƣời, gây ô nhiễm môi trƣờng, tăng tính kháng
của dịch hại, tiêu diệt hệ thiên địch, phá vỡ mối cân bằng sinh thái trong tự nhiên, gây
ra nhiều vụ bùng nổ về số lƣợng lớn sâu hại. Quan sát thực tế thấy rằng, ngoài tác
dụng của thuốc hoá học gây chết côn trùng còn có nấm ký sinh cũng gây chết côn
trùng. Các loại nấm ký sinh côn trùng trong tự nhiên rất phong phú và đa dạng, có hơn
700 loài nấm gây hại cho côn trùng hầu hết thuộc bộ Moniliales (Deuteromycetes) và
bộ Entomophthorales (Phycomyces) gây bệnh cho hơn 90 loại côn trùng (Charley,
1989). Việc sử dụng vi sinh vật gây hại côn trùng để quản lý sâu hại là biện pháp sinh
học lý tƣởng. Việc dùng biện pháp sinh học sẽ đem lại hiệu quả tốt và ít ảnh hƣởng
đến môi trƣờng cũng nhƣ sức khoẻ con ngƣời. Do vậy, trong những năm gần đây, đã
có nhiều nghiên cứu về lĩnh vực này nhằm tạo ra một nền nông nghiệp sạch và bền
vững.
Trong các loài vi sinh vật gây hại côn trùng đáng chú ý nhất là ngành phụ nấm
bất toàn mà quan trọng là nấm Metarrhizium anisopliae - một trong các loài có tính
diệt côn trùng mạnh nhất.
Nói chung, trên thế giới nấm Metarrhizium anisopliae và một số loại nấm khác
nhƣ Baeuveria bassiana, Normurea đã đƣợc nghiên cứu, sử dụng và thƣơng mại hóa
từ lâu – nhƣ là một loại thuốc trừ sâu sinh học trong công tác phòng chống một số loại
sâu hại thuộc bộ cánh phấn (Lepidoptera), và cánh cứng (Coleoptera) trên nhiều loại
cây trồng khác nhau.
Ở nƣớc ta, những nghiên cứu về đặc tính sinh học, khả năng gây độc, xác định
sự đa dạng sinh học của nấm Metarrhizium anisopliae vẫn chƣa rộng và chỉ thực hiện


2
ở mức độ hình thái. Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên nhiều loại côn trùng
của nhiều loại cây trồng khác nhau nhƣ trên sâu róm, sâu tơ, sâu khoang (ở miền Bắc);
trên rầy nâu, bọ xít đen, sâu cuốn lá lúa, sâu cắn gié, sâu xanh da láng, sâu tơ, bọ dừa,
rệp xáp, cào cào (ở miền Nam) (Phạm Thị Thuỳ và ctv, 2000).
Trong chiều hƣớng tiến đến xây dựng một nền nông nghiệp hàng hoá với sản
phẩm sạch và chất lƣợng cao, không ca ngợi và lạm dụng thuốc trừ sâu hoá học thì
việc nghiên cứu sâu hơn về các loại nấm này cần đƣợc quan tâm. Từ khi Metarrhizium
anisopliae có mặt ở khắp nơi, đòi hỏi phải có các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại để
xác định gen gây độc của chúng nhằm chọn lọc ra những chủng nấm Metarrhizium
anisopliae có tính độc cao đảm bảo hoạt tính trừ sâu lâu dài và hiệu quả. Sự mô tả
đúng và chính xác những loài nấm Metarrhizium anisopliae sẽ đánh giá đƣợc tầm
quan trọng lớn nhất cho việc nghiên cứu nấm ký sinh côn trùng nhƣ là tác nhân phòng
trừ sinh học ở những loài côn trùng khác nhau.
Một số kỹ thuật sinh học phân tử thật sự hữu hiệu trong việc nghiên cứu sâu
hơn về loại nấm này đã đƣợc sử dụng nhiều nơi trên thế giới nhƣ kỹ thuật PCR phát
hiện sự hiện diện của gen Pr1 (protease) của nấm Metarrhizium anisopliae; kỹ thuật
RFLP, RAPD dùng để xác định sự đa dạng di truyền của gen gây độc Pr1 giữa những
dòng nấm Metarrhizium anisopliae; đặc biệt là kỹ thuật sequencing có thể xác định
đƣợc cụ thể trình tự nucleotide của đoạn gen gây độc này.
Gen Pr1 là một chymoelastase, trở thành một yếu tố quyết định tác nhân gây
bệnh. Pr1 đƣợc sản xuất ra để ức chế carbon catabolite, nitrogen metabolite ở lớp biểu
bì côn trùng.
Trên cơ sở chƣa có báo cáo khoa học nào trong nƣớc nghiên cứu sâu hơn về
gen qui định tính độc và sự đa dạng di truyền bằng các phƣơng pháp phân tử hiện đại.
Xuất phát từ vấn đề trên chúng tôi thực hiện đề tài:”Xác định gen gây độc Pr1 và
tính đa dạng di truyền đoạn gen Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae trên côn
trùng gây hại.”
1.2. Mục đích và yêu cầu đề tài
1.2.1. Mục đích
Làm cơ sở khoa học cho việc xác định đa dạng di truyền và xác định gen gây
độc nhằm tạo ra đƣợc thuốc trừ sâu sinh học có hoạt tính ổn định và hiệu quả đối với
từng loại cây trồng, đáp ứng nhu cầu trong công tác bảo vệ thực vật hiện nay.


3
1.2.2. Mục tiêu
Xác định gen Pr1 và tìm sự khác biệt trong trình tự nucleotide của đoạn gen
Pr1 giữa các dòng nấm Metarrhizium anisopliae.
1.2.3. Yêu cầu nghiên cứu
Phân lập các dòng nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên nhiều loại
côn trùng ở những cây trồng khác nhau.
Phát hiện gen gây độc Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae bằng
phƣơng pháp PCR.
Xác định trình tự nucleotide của đoạn gen gây độc Pr1.
1.3. Đối tƣợng nghiên cứu
Nấm Metarrhizium anisopliae thu thập ở các tỉnh thành khác nhau nhƣ: Long
An, Trà Vinh, Tây Ninh, Tiền Giang, Bến Tre, Quận 2 thành phố Hồ Chí Minh, Quận
9 thành phố Hồ Chí Minh gây hại cho côn trùng trên các đối tƣợng cây trồng khác
nhau.

Xem chi tiết: Xác định gen gây độc và tính đa dạng di truyền